病毒基因工程国家重点实验室 金奇

　　微生物学研究进入分子水平

　　微生物是包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活密切相关。微生物在自然界中可谓“无处不在，无处不有”，涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、医药、工农业、环保等诸多领域。

　　微生物对人类最重要的影响之一是导致传染病的流行。在人类疾病中有50％是由病毒引起。世界卫生组织公布资料显示：传染病的发病率和病死率在所有疾病中占据第一位。微生物导致人类疾病的历史，也就是人类与之不断斗争的历史。在疾病的预防和治疗方面，人类取得了长足的进展，但是新现和再现的微生物感染还是不断发生，像大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治疗药物。一些疾病的致病机制并不清楚。大量的广谱抗生素的滥用造成了强大的选择压力，使许多菌株发生变异，导致耐药性的产生，人类健康受到新的威胁。一些分节段的病毒之间可以通过重组或重配发生变异，最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大流行流感病毒都与前次导致感染的株型发生了变异，这种快速的变异给疫苗的设计和治疗造成了很大的障碍。而耐药性结核杆菌的出现使原本已近控制住的结核感染又在世界范围内猖獗起来。

　　微生物能够致病，能够造成食品、布匹、皮革等发霉腐烂，但微生物也有有益的一面。最早是弗莱明从青霉菌抑制其它细菌的生长中发现了青霉素，这对医药界来讲是一个划时代的发现。后来大量的抗生素从放线菌等的代谢产物中筛选出来。抗生素的使用在第二次世界大战中挽救了无数人的生命。一些微生物被广泛应用于工业发酵，生产乙醇、食品及各种酶制剂等；一部分微生物能够降解塑料、处理废水废气等等，并且可再生资源的潜力极大，称为环保微生物；还有一些能在极端环境中生存的微生物，例如：高温、低温、高盐、高碱以及高辐射等普通生命体不能生存的环境，依然存在着一部分微生物等等。看上去，我们发现的微生物已经很多，但实际上由于培养方式等技术手段的限制，人类现今发现的微生物还只占自然界中存在的微生物的很少一部分。

　　微生物间的相互作用机制也相当奥秘。例如健康人肠道中即有大量细菌存在，称正常菌群，其中包含的细菌种类高达上百种。在肠道环境中这些细菌相互依存，互惠共生。食物、有毒物质甚至药物的分解与吸收，菌群在这些过程中发挥的作用，以及细菌之间的相互作用机制还不明了。一旦菌群失调，就会引起腹泻。

　　随着医学研究进入分子水平，人们对基因、遗传物质等专业术语也日渐熟悉。人们认识到，是遗传信息决定了生物体具有的生命特征，包括外部形态以及从事的生命活动等等，而生物体的基因组正是这些遗传信息的携带者。因此阐明生物体基因组携带的遗传信息，将大大有助于揭示生命的起源和奥秘。在分子水平上研究微生物病原体的变异规律、毒力和致病性，对于传统微生物学来说是一场革命。

　　以人类基因组计划为代表的生物体基因组研究成为整个生命科学研究的前沿，而微生物基因组研究又是其中的重要分支。世界权威性杂志《科学》曾将微生物基因组研究评为世界重大科学进展之一。通过基因组研究揭示微生物的遗传机制，发现重要的功能基因并在此基础上发展疫苗，开发新型抗病毒、抗细菌、真菌药物，将对有效地控制新老传染病的流行，促进医疗健康事业的发展产生巨大影响。牛痘疫苗的应用使人类历史上首次成功消灭了一种疾病——天花，而目前的基因工程疫苗也为疾病的有效预防发挥了巨大作用，如乙肝病毒的预防等。

　　从分子水平上对微生物进行基因组研究为探索微生物个体以及群体间作用的奥秘提供了新的线索和思路。为了充分开发微生物（特别是细菌）资源，1994年美国发起了微生物基因组研究计划（MGP）。通过研究完整的基因组信息开发和利用微生物重要的功能基因，不仅能够加深对微生物的致病机制、重要代谢和调控机制的认识，更能在此基础上发展一系列与我们的生活密切相关的基因工程产品，包括：接种用的疫苗、治疗用的新药、诊断试剂和应用于工农业生产的各种酶制剂等等。通过基因工程方法的改造，促进新型菌株的构建和传统菌株的改造，全面促进微生物工业时代的来临。

　　我国微生物基因组研究已经占据一定国际地位

　　由于微生物相对于其他生物体而言结构简单、基因组较小，因此研究周期短，进展迅速。世界各国普遍参与并关注该领域的发展。目前病毒基因组研究已全面进入功能基因的研究阶段；细菌基因组研究全面展开，在大量测序工作进行的同时，功能基因组的研究也已在进行之中；部分真菌和小型原虫的基因组研究也逐渐展开。从1995年国际上第一个细菌流感嗜血杆菌全基因组测定完成，在随后的几年中，微生物（这里包括细菌和真菌）的全基因组序列测定进展很快，仅2000年一年就公布了15种微生物的完整序列。截止到现在，总共完成了微生物基因组研究40多项，基因组大小从几百kb（千碱基对）到十几个Mb（兆碱基对），还有160多种微生物的测序工作正在进行之中。

　　鉴于微生物在多领域发展中具有重要价值，因此国际上许多国家纷纷制订了微生物基因组研究计划，对微生物基因资源的开发展开了激烈竞争。发达国家和一些发展中国家首先对人类重要病原微生物进行了大规模的序列测定，随后又对有益于能源生产、改善环境以及工业加工的细菌开展了基因组序列测定工作。

　　在此期间，我们国家在侯云德院士、闻玉梅院士等老一辈科学家的倡导下，也及时开展了微生物基因组工程的研究。在强伯勤院士的大力支持下，由金奇教授主持完成的痢疾杆菌福氏2a301株的全基因组序列测定，是我国第一个向国际上发布并率先完成的微生物基因组项目。在陈竺院士和杨焕明教授等领导下的病原微生物钩端螺旋体、滕冲嗜热菌及黄单胞菌等的全基因组序列测定也先后完成，后续的功能基因组研究正在进展之中。目前即将完成的有工业菌株氧化葡萄糖酸杆菌、青霉菌及病原菌表皮葡萄球菌等。将要启动的新一批微生物基因组项目包括人类病原微生物、工业微生物、环境保护微生物等等。这标志着我国在微生物基因组研究领域中已经占据了一定的国际地位，同时也为发展我国有自主知识产权的微生物基因资源的开发和产业化奠定了基础。

　　人类病原微生物基因组研究设计新型疫苗开发新型抗微生物药物

　　由于新老传染病的流行和再现，病原微生物的变异和致病机制更加复杂和多样化。因此，迫切需要我们从更深层次去了解和研究它们，而基因组研究则从分子水平上奠定了坚实的基础。在遗传信息解析的前提下，为临床治疗中寻找更灵敏特异的诊断分型手段、发展高效的基因工程疫苗及筛选新型药物提供了线索和保障。

　　科学家们对大量基因组资料分析后发现，在微生物的染色体上，一些功能相近的基因毗邻分布形成“小岛”样的结构。这些岛包括“毒力岛”、“代谢岛”，甚至可能还存在着“分泌岛”、“调控岛”等等。毒力岛的发现和研究使人类在认识细菌的致病性方面更进了一步。

　　有科学家认为，人类病原微生物基因组研究最重要的价值就在于其对疫苗的设计以及新型抗微生物药物的开发所产生的巨大推动。从反向疫苗学的角度首先对全基因组序列进行生物信息学分析，预测开放读码框架（ORF，openreadingframe），发现新的外膜蛋白基因，筛选表达保护性抗原，以制备高效疫苗。这种思路已在衣原体的研究中取得成功。在一系列研究中发展起来的新技术和新方法对于促进功能基因的发现和重要功能基因的研究显得尤为重要。通过这些方法的应用发现了一系列与毒力、耐药和定居等相关的基因，并且可以在此基础上深入研究病原体与宿主的相互作用。

　　大肠杆菌作为人体正常菌群中重要的一员，同时也被作为基因组研究的模式生物，较早完成了其基因组序列的测定。而致病性的大肠杆菌，如大肠杆菌O157的基因组研究也已完成，将非致病的大肠杆菌和致病性的大肠杆菌进行序列的比较，就可以得到许多有价值的资料，例如：与致病性相关的基因，以及一些保守性的共有基因等。科学家对与慢性胃炎和胃癌可能相关的病原菌幽门螺杆菌进行的研究发现，该菌具有特殊的基因使之能在胃酸存在的条件下生存，从而被人体长期携带，在该研究的基础上可以探讨其与癌症发生相关的分子机制。引起沙眼的沙眼衣原体以及导致性病的梅毒螺旋体等大量疾病的致病微生物正处于研究阶段。

　　科学家们希望发现病原生物致病相关的关键基因或基因群，从而有针对性地发展更为有效的防治对策，而微生物在宿主组织中生长所需要的物质合成、分解代谢以及调节相关基因都可以作为抗微生物药物设计的候选靶位。微生物完整的基因组序列提供了丰富的信息资源，为发现新的、更有效的药物靶位和保护性抗原提供了最大的可能。

　　大量基因组序列的积累，促进了比较基因组学的发展。以微生物序列信息为杠杆，加快了其它种类生物测序，同时也促进了微生物本身独特核苷酸序列的发现，为临床治疗发展更灵敏特异的诊断分型方法奠定了基础；微生物与人类相似的致病相关蛋白的发现，也为人类遗传病的研究提供了线索。

　　工业微生物基因组研究不断发现新的特殊酶基因及功能基因

　　工业微生物涉及食品、制药、冶金、采矿、石油、皮革、轻化工等多种行业。通过微生物发酵途径生产抗生素、丁醇、维生素C以及一些风味食品的制备等；某些特殊微生物酶参与皮革脱毛、冶金、采油采矿等生产过程，甚至直接作为洗衣粉等的添加剂；另外还有一些微生物的代谢产物可以作为天然的微生物杀虫剂广泛应用于农业生产。通过对枯草芽孢杆菌的基因组研究，发现了一系列与抗生素及重要工业用酶的产生相关的基因。乳酸杆菌作为一种重要的微生态调节剂参与食品发酵过程，对其进行的基因组学研究将有利于找到关键的功能基因，然后对菌株加以改造，使其更适于工业化的生产过程。国内维生素C两步发酵法生产过程中的关键菌株氧化葡萄糖酸杆菌的基因组研究，将在基因组测序完成的前提下找到与维生素C生产相关的重要代谢功能基因，经基因工程改造，实现新的工程菌株的构建，简化生产步骤，降低生产成本，继而实现经济效益的大幅度提升。对工业微生物开展的基因组研究，不断发现新的特殊酶基因及重要代谢过程和代谢产物生成相关的功能基因，并将其应用于生产以及传统工业、工艺的改造，同时推动现代生物技术的迅速发展。

　　农业微生物基因组研究认清致病机制发展控制病害的新对策

　　据资料统计，全球每年因病害导致的农作物减产可高达20％，其中植物的细菌性病害最为严重。除了培植在遗传上对病害有抗性的品种以及加强园艺管理外，似乎没有更好的病害防治策略。因此积极开展某些植物致病微生物的基因组研究，认清其致病机制并由此发展控制病害的新对策显得十分紧迫。

　　经济作物柑橘的致病菌是国际上第一个发表了全序列的植物致病微生物。还有一些在分类学、生理学和经济价值上非常重要的农业微生物，例如：胡萝卜欧文氏菌、植物致病性假单胞菌以及我国正在开展的黄单胞菌的研究等正在进行之中。日前植物固氮根瘤菌的全序列也刚刚测定完成。借鉴已经较为成熟的从人类病原微生物的基因组学信息筛选治疗性药物的方案，可以尝试性地应用到植物病原体上。特别像柑橘的致病菌这种需要昆虫媒介才能完成生活周期的种类，除了杀虫剂能阻断其生活周期以外，只能通过遗传学研究找到毒力相关因子，寻找抗性靶位以发展更有效的控制对策。固氮菌全部遗传信息的解析对于开发利用其固氮关键基因提高农作物的产量和质量也具有重要的意义。

　　环境保护微生物基因组研究找到关键基因降解不同污染物

　　在全面推进经济发展的同时，滥用资源、破坏环境的现象也日益严重。面对全球环境的一再恶化，提倡环保成为全世界人民的共同呼声。而生物除污在环境污染治理中潜力巨大，微生物参与治理则是生物除污的主流。微生物可降解塑料、甲苯等有机物；还能处理工业废水中的磷酸盐、含硫废气以及土壤的改良等。微生物能够分解纤维素等物质，并促进资源的再生利用。对这些微生物开展的基因组研究，在深入了解特殊代谢过程的遗传背景的前提下，有选择性的加以利用，例如找到不同污染物降解的关键基因，将其在某一菌株中组合，构建高效能的基因工程菌株，一菌多用，可同时降解不同的环境污染物质，极大发挥其改善环境、排除污染的潜力。美国基因组研究所结合生物芯片方法对微生物进行了特殊条件下的表达谱的研究，以期找到其降解有机物的关键基因，为开发及利用确定目标。

　　极端环境微生物基因组研究深入认识生命本质应用潜力极大

　　在极端环境下能够生长的微生物称为极端微生物，又称嗜极菌。嗜极菌对极端环境具有很强的适应性，极端微生物基因组的研究有助于从分子水平研究极限条件下微生物的适应性，加深对生命本质的认识。

　　有一种嗜极菌，它能够暴露于数千倍强度的辐射下仍能存活，而人类一个剂量强度就会死亡。该细菌的染色体在接受几百万拉德a射线后粉碎为数百个片段，但能在一天内将其恢复。研究其DNA修复机制对于发展在辐射污染区进行环境的生物治理非常有意义。开发利用嗜极菌的极限特性可以突破当前生物技术领域中的一些局限，建立新的技术手段，使环境、能源、农业、健康、轻化工等领域的生物技术能力发生革命。来自极端微生物的极端酶，可在极端环境下行使功能，将极大地拓展酶的应用空间，是建立高效率、低成本生物技术加工过程的基础，例如PCR技术中的TagDNA聚合酶、洗涤剂中的碱性酶等都具有代表意义。极端微生物的研究与应用将是取得现代生物技术优势的重要途径，其在新酶、新药开发及环境整治方面应用潜力极大。

　　古生菌基因组工程一门新兴学科

　　古生菌作为分类上的一个特殊类群，由于其在进化研究中的特殊地位，近年来受到科学家们的格外关注。1996年，詹氏甲烷球菌成为第一个完成全基因组测序的古生菌，其基因组序列分析发现，甲烷球菌不像任何已知细菌。这一现象支持和肯定了古生菌的确是一个独立的域，也进一步支持了三域（细菌、古生菌和真核生物）划分的正确性。古生菌的大部分分支为嗜热菌，其嗜热酶多数可应用于工业生产中的生物催化。古生菌的研究还是一门新兴学科，一些基本的生物学知识还非常贫乏。对古生菌开展基因组研究，将从遗传基础方面加深我们对古生菌的认识，以便于更好地开发和利用。

　　技术手段飞跃发展高通量大规模

　　开展基因组研究的同时，相应的生物技术手段得到了飞跃性的发展。基因组研究在技术上最突出的特点是：高通量、大规模。这是传统生物技术的一次重大突破，已经成为解决生命科学的重大问题和复杂生命过程发生机制的强有力的手段。随着后基因组研究和蛋白质组学的提出，在这些功能强大的研究工具中最突出的，是生物芯片技术和细胞蛋白质二维凝胶电泳技术。科学家成功地应用157112个探针分子，一次性检测了酵母几种不同株间数千个基因表达谱的差异；而二维电泳技术的出现，使高通量的蛋白质筛选成为可能，其结合质谱分析和蛋白质组的信息学，将给蛋白质的功能研究带来革命性的进展。

　　微生物基因组研究四大目标

　　目标一：深化病原微生物致病机制的研究

　　将不同微生物间进行基因组结构和功能基因的比较，促进对结构改变与功能变异之间的相关性研究，不断引导发现新的核心序列、特异序列及耐药位点，推动致病因子存在、发生、变异和调节规律的研究。毒力基因的改变将导致微生物致病性的改变，如，霍乱弧菌由自由生活的环境生物转变为人类病原菌的关键因素，就是毒力基因的水平转移；而基因在不同种属、甚至不同域之间转移，就更增加了生物的多样性和进化的复杂性。从整体的角度以完整基因组序列为基础结合功能基因组学研究的实验方法，如：芯片技术、二维电泳技术、各种功能基因的筛选技术等快速、大量的鉴定新的致病相关因子，结合生物信息学构建各种生理过程的数学模型进行研究，将深化对致病机制、耐药机制的认识，为防病治病奠定基础。

　　技术的进步使我们的研究能力得以提高，研究范围不断拓展。新的技术手段和研究方法使我们可以在最接近自然的状态下研究病原微生物与宿主的相互作用，还能在大量的候选基因中快速有效地进行筛选。哪些基因与毒力有关、与定居有关、与持续感染有关等等，有待开展的工作还很多。对幽门螺杆菌、空肠弯曲菌、结核杆菌以及一些寄生性的病原体，如支原体、立克次体和麻风杆菌等与宿主及生存环境相互关系的研究已经是良好的开端。例如，幽门螺杆菌遗传信息的解析，不仅为其特殊代谢提供了信息和线索，阐明了该菌如何生活在宿主的胃酸环境中，并且有助于研究长期带菌者体内的病原微生物与宿主的相互关系，在此基础上还有望识别对致癌有重要作用的因素；而对麻风杆菌基因组的分析，则可能有助于寻找到在实验室中培养麻风杆菌的方法，便于科学家对它进行更深入的研究。

　　目标二：推动生命进化的研究

　　基因组遗传信息的解析推动了生命进化的研究。目前广泛为人接受的是伯杰氏分类法，他将生物分为三域：真核生物、真细菌和古生菌。古生菌与真核生物的关系要比与真细菌的关系更为密切。微生物基因组测序的信息进一步验证了生命进化的三域理论。大量致病和非致病性微生物基因组的研究证明基因的水平转移机制致使很多基因可在生物体中跨域分享，这对于研究生物的系统发生很有意义，相信越来越多的基因组信息的积累和分析，将对绘制科学的生命进化提供更丰富的信息和更有力的证据。

　　目标三：开发诊断试剂、构建疫苗、筛选药物，为防病治病服务

　　完整基因组的序列测定带给我们有关微生物详尽的遗传学和生物学信息，是其他任何一种研究方法所不能比拟的。以完整的基因组序列为基础，预测和筛选出新的更特异的保护性抗原基因，在此基础上发展高效疫苗；鉴定新的毒力相关因子、调节因子，经过遗传学操作改造疫苗菌株、构建活疫苗以及发展基因工程菌载体的构建。以分子模拟等生物信息学方法对小分子药物进行设计和筛选，以期获得针对性强、副作用小的好药。微生物的特异序列还可用以制备疾病的诊断试剂，结合大规模的检测方法，如基因芯片技术等，应用于疾病快速及时的诊断和分型，以及研究基因突变和多态性的存在。可以预见，这一领域的发展潜力巨大，前景广阔。

　　目标四：促进传统工艺的改良、传统工农业的改造

　　一直以来，直接利用菌体进行发酵或直接利用菌的代谢产物，在化工、制药及食品等工业部门应用广泛。基于微生物基因组的研究，将不断发现重要的关键基因，明确关键的代谢机制尤其是相关酶基因及其蛋白产物，将蛋白制剂直接应用于生产过程或对基因进行遗传操作，改造菌株或构建新的基因工程菌，对扩大应用领域，改良或简化传统工艺步骤，提高生产效率，甚至以新的生物技术手段对传统工业的现代化改造，将产生深远影响。

　　对经济作物致病菌的基因组研究应逐渐加强，从分子水平上掌握致病规律，发展防治新对策；将微生物中抗冻、抗虫、耐盐碱、固氮等优良基因转入经济作物体内，减少化肥和农药的使用，同时发展生物杀虫剂，减少污染，不断提高农产品的产量和质量、促进传统农业的现代化改造。

　　微生物基因组研究成果，不仅可以极大推动理论科学的发展，还能以疫苗、新型药物、诊断试剂、极端酶等各种酶制剂、工程菌等多种形式广泛应用于生物医药、工农业生产、生物除污、传统工艺、工业的改良改造，新型生物技术的发生发展等诸多领域。一种以微生物为研究和开发主体的工业时代即将来临。其中，微生物基因组研究所开辟和发展的丰富资源，对于这种新的微生物工业的形成和发展将产生巨大的推动作用。

　　作者简介

　　金奇教授，男，42岁，博士生导师，现任病毒基因工程国家重点实验室副主任；

　　卫生部微生物基因组研究中心负责人；

　　北京微生物基因组研究中心主任；

　　生物芯片北京国家工程研究中心副主任。

　　现任国家重大基础研究规划（973规划）项目首席科学家；

　　国家高技术发展计划（863计划）生物与现代农业领域主题专家组组长。

　　摘自读者园地：www.labrary.sh.cn